人转移胰腺腺癌细胞吉西他滨耐药株（ASPC-1/GEM）                             
细胞介绍
一个胰腺癌病人的腹水中的细胞移植到裸鼠后建立了这个细胞株。
细胞特性

1. 来源：ASPC-1耐药筛选
2. 形态：上皮细胞样，贴壁生长
3. 含量：>1×10⁶  细胞数             
4. 用途：仅供科研使用

细胞运输、保存及注意事项

	复苏细胞	冻存细胞
包装	充液的T25细胞培养瓶	1mL冻存管
运输条件	常温	干冰
保存方式	75%酒精消毒瓶壁，置于37℃恒温细胞培养箱	-80℃冰箱中保存过夜后转入液氮/立即复苏
注意事项	收到细胞请先就培养瓶/冻存管的外观、细胞的状态，进行拍照并保存，如有问题请及时联系我们； 收到的复苏细胞，若有较多细胞飘起，可能由于运输导致。请先置于37℃细胞培养箱中静置2~4h，待细胞贴壁后再做处理； 复苏细胞充液培养基为不含药物的维持培养基，收到细胞后请及时更换为完全培养基； 建议收到细胞后，首先进行扩增，并冻存部分细胞以备用。

细胞耐药诱导过程
待细胞生长稳定后，开始倍增药物诱导剂量，每个剂量保持至细胞可以稳定生长至汇合度达50%以上。递增药物浓度依次为：0.03μg/mL、0.3μg/mL、1.5μg/mL、3μg/mL、6μg/mL、12μg/mL、18μg/mL。约10个月后，细胞可在18μg/mL GEM药物浓度下稳定生长，视为耐药细胞株构建成功，并命名为ASPC-1/GEM。
细胞培养试剂的配制

1. GEM药物的配制及保存

建议将GEM药物配制成18mg/mL的母液：即使用1mL DMSO溶液溶解18mg GEM药物，使其完全溶解。
注意：可根据用量配置药物，并将药物分装保存，避免反复冻融导致药物失效。溶解后的GEM，4℃保存1周，-20℃保存1个月，-80℃保存6个月。

1. 冻存液的配制

90%优质胎牛血清+10%DMSO，现用现配。

1. 完全培养基的配制（推荐使用h005-001b）

成分	体积/浓度
优质胎牛血清	10%
双抗	1%
GlutaMAX-1谷氨酰胺	1%
GEM	0~18μg/mL
DMEM培养基	补充至所需体积

细胞培养条件
气相：空气，95%；二氧化碳，5%；温度：37℃，培养箱湿度为70%~80%。
细胞处理
1）冻存细胞的复苏
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4~6mL完全培养基的离心管中混合均匀，1000rpm/min离心3~5min，弃去上清液。加入1mL完全培养基重悬细胞后，均匀铺于含6~8mL完全培养基的培养瓶（或皿）中，置于37℃恒温细胞培养箱中过夜培养。第二天显微镜下观察细胞生长情况，2~3day换液。
注意：①细胞复苏过程中，不可使用含有药物的培养基。须在细胞完全贴壁，形态完全展开，生长状态稳定后，方可根据实验需要添加GEM药物。若加药后细胞生长状态较为缓慢，可适当降低GEM的浓度，或使用不含GEM的完全培养基培养至细胞生长状态较好时，再更换为所需的GEM浓度；
②建议复苏细胞时始终穿戴防护手套和面罩，避免冻存管因温差较大而发生爆炸，造成人员伤害。
2）细胞传代（建议以同等底面积的培养瓶/皿按照1：2比例传代）
①待细胞密度达到80%~90%时，即可进行传代培养。
②弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1次，吸净残余的PBS。
③加入适当体积的0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶-1mL，其它培养器皿可覆盖培养底面即可），置于37℃培养箱中消化2~5min，显微镜下观察细胞细胞大部分变圆并脱落，即可轻拍培养瓶使细胞全部脱落。迅速拿回操作台，加入2倍体积的、含10%FBS的培养基中止消化。 
④将细胞悬液移入离心管中，1000rpm/min离心5min，弃去上清液。
⑤向细胞沉淀中加入1~2mL完全培养基重悬细胞，轻吹混匀。将细胞悬液按1：1的比例均匀铺于2个新的培养瓶/皿中，添加6~8mL完全培养基，置于37℃恒温细胞培养箱中培养。第二天显微镜下观察细胞生长情况，2~3day换液。
注意：细胞传代过程中，不可使用含有药物的培养基。须在细胞完全贴壁，形态完全展开，生长状态稳定后，方可根据实验需要添加GEM药物。若加药后细胞生长状态较为缓慢，可适当降低GEM的浓度，或使用不含GEM的完全培养基培养至细胞生长状态较好时，再更换为所需的GEM浓度。
3）细胞冻存
①细胞冻存时，步骤同2）细胞传代的①~④，细胞计数后，加入配制好的细胞冻存液，重悬细胞，按照1×10⁶ ~ 1×10⁷个细胞/mL分配到一个冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。
②将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。