动物细胞/组织溶酶体分离试剂盒

描述：
溶酶体是真核细胞中负责清除废物的球形囊泡。溶酶体中的消化酶在消化多余或受损的细胞
器、食物颗粒、吞噬的病毒和细菌中起着至关重要的作用。溶酶体是相对较大的细胞器，大小从
0.1 到 1.2μm 不等。分离溶酶体是研究细胞自噬、蛋白质降解和蛋白质再循环重要的第一步。传统
的溶酶体分离方法是基于 20 世纪 70 年代开发的技术，需要大量的起始材料和繁琐的过程，严重
的交叉污染不可避免。本试剂盒利用离心管柱技术，简单、快速、高效。无需使用杜恩斯匀浆器
和超高速离心，即可显著富集天然溶酶体，整个操作耗时不超过 90 分钟 。所需的起始细胞/组织
的量远小于传统方法。
试剂盒组份 (20 Preps):
1. Buffer A 15ml
2. Buffer B 2ml
3. 塑料研磨棒 2 个
4. 离心管柱 20 个
5. 接收管 20 个
所需附加材料：
1XPBS，涡旋震荡仪，台式离心机 (10s 内离心力可达 16,000Xg)
运输及储存：

常温运输，4℃储存。

 

重要产品信息：
1. 仔细阅读整个操作说明。将离心管柱（Filter Cartridges）套入接收管成为套管放置于冰上预冷。
2. 所有离心步骤都需要在 4℃室温下或者低温离心机中进行。
3. 对于蛋白磷酸化研究，磷酸酶抑制剂应在使用前加入缓冲液 A 中。如果担心蛋白质降解，使用前可在 Buffer
A 和 Buffer B 中添加蛋白酶抑制剂。（请按照蛋白酶或磷酸酶抑制剂母液比例，例如母液是 100X，添加时
按照 1：100 添加，即 1ml 缓冲液中添加 10ul 抑制剂）
4. 推荐使用 BCA 法进行蛋白浓度测定。
操作步骤：
1. 将离心管柱（Filter Cartridges）套入接收管成为套管放置于冰上预冷。
2. 细胞样品，低速离心（500-600Xg，5 分钟）收集 25-30x 106 个细胞。用预冷的 PBS 清洗细胞
一次，完全去除上清，加入 500μl Buffer A 重悬细胞沉淀，在冰上孵育 5-10 分钟，大力涡旋震
荡 10-30 秒。迅速将细胞悬液转入离心管柱套管中。转接步骤 4。
3. 组织样品，将 20-30mg 组织（新鲜或冷冻）放置于离心管柱套管中。加入 200μl Buffer A，用
塑料棒向下按压反复扭转研磨组织 1 分钟。再加入 300μl Buffer A，用移液器上下吹打混匀，
开盖在冰上孵育 5 分钟。转接步骤 4.
注意：塑料棒是重复使用的，可以用 70%的酒精或者水清洗。
4. 盖上盖子，翻转几次混匀，16,000X g，离心 30 秒。（此步骤需离心机在 10S 内到达 16,000Xg，
否则可能影响得率）
（可选优化：细胞样品过柱之后，可以再次重悬接收管中沉淀，转移回同个离心管柱中再次过柱
增加产量）
5. 弃去离心管柱，剧烈涡旋 10S 重悬接收管中沉淀，2,000X g，离心 3min。沉淀包含细胞核，大
的细胞碎片和一些未破碎的细胞（如有）。
6. 将所有上清转移到新的 1.5ml 离心管中，4℃，11,000X g，离心 15min。此步所得沉淀主要包
含线粒体和细胞碎片。小心将 400ul 上清转移至一个新的 1.5ml 离心管中，16,000Xg，4 oC，
离心 30min，完全去除上清。
7. 加入 200ul 预冷的 Buffer A,用吸头反复吹打 60-100 次重悬沉淀后，剧烈涡旋震荡 20s 混匀。
2,000Xg，4℃，离心 4min。小心的将上清转移至一个新的 1.5ml 离心管中，加入 100ul Buffer B,
短暂涡旋混匀（注意：此处上清和 Buffer B 的比例是 2：1）。在冰上孵育 30min，11,000X g，
离心 10min，将上清完全去除干净。将管子再次 11,000X g 离心几秒钟，去除残留液体。
8. 沉淀为高度富集的溶酶体组分，可根据下游应用使用 50-150ul 溶解液或适合的溶液重悬沉淀
（见下表格）。推荐根据下游实验从下表中选择合适的 Minute TM 系列溶解液溶解溶酶体。 ​