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HE染色的实验原理方法及注意事项

人阅读 发布时间:2023-01-06 08:59

 HE染色全名为苏木晶(hematoxylin)和伊红(eosin)染色方法,是最基本的也是最重要的病理学染色技术。

       HE染色是目前国内外病理诊断上广泛采用的 常规染色方法。一张好的HE切片是保证正确病理诊断的关键。切片质量的好坏,可直接影响疾病诊断的及时与准确性。作为一个合格的实验技术员,能制作出一张高质量的HE染色切片,是必须掌握的一门重要功课。
        HE染色的实验原理及注意事项
       一、细胞核染色原理:
       苏木晶为碱性天然染料,可使细胞核着色。细胞核内染色质的成分主要是DNA,在DNA的双螺旋结构中,两条核苷酸链上的磷酸基向外,使DNA双螺旋的外侧带负电荷,呈酸性,很容易与带正电荷的苏木jing碱性燃料以离子键或氢键结合而被染色。苏木jing在碱性溶液中呈蓝色,所以细胞核被染成蓝色。
       二、细胞浆染色原理:

       细胞浆内主要成分是蛋白质,为两性化合物、细胞浆的染色与pH值有密切关系,当pH调到蛋白质等电点4.7-5.0时,胞浆对外不显电性,此时酸或碱性染料不易染色。当pH调到6.7-6.8时,大于蛋白质的等电点pH值,表现酸性电离,而带负电荷的阴离子,可被带正电荷的染料染色,现时胞核也被染色,核和胞浆难以区分。因此必须把pH调至胞浆等电点以下,在染液中加入醋酸使胞浆带正电荷(阳离子),就可被带负电荷(阴离子)的染料染色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料,在水中离解成带负电荷的阴离子,与蛋白质的氨基正电荷(阳离子)结合而使细胞浆染色,细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织,嗜伊红颗料等被感染成不同程度的红色或粉红色,与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。

 

 

       三、分化作用:
       染色后,用某些特定的溶液将组织过多结合的染色剂脱去,这个过程称为分化作用,所用的溶液称为分化液。在HE染色中用0.5%盐酸乙醇作为分化液,因酸能破坏苏木晶的醌型结构,使组织与色素分离而褪色。经苏木晶染色后,必须用0.5%盐酸乙醇分化,使细胞核过多结合的苏木晶染料和细胞浆吸附的苏木晶染料脱去,在进行伊红染色,才能保证细胞核与细胞浆染色的分明。因此,在HE染色中分化是极为关键的一步。
       四、返蓝作用:
       分化之后,苏木晶在酸性条件下处于红色离子状态,呈红色,在碱性条件下处于蓝色离子状态,呈蓝色。组织切片经0.5%盐酸乙醇分化后呈红色或粉红色,故分化之后,立即用水除去组织切片上的酸而终止分化,再用弱碱性水(0.2%安水)使苏木晶染上的细胞核呈现蓝色,这个过程称为返蓝作用或蓝化作用。另外用自来水浸洗也可使细胞核返蓝,但所需时间较长。
       实验材料
       固定液:常用95%乙醇和冰丙酮
       苏木晶染液:称取苏木晶粉0.5g,铵矾24g溶解于70ml蒸馏水中,然后取NaIO 31g,水5ml,再加入甘油30ml和冰醋suan 2ml,混合均匀,滤纸过滤,备用。
       伊红染液:称取0.5g水溶性伊红染液,溶于100ml蒸馏水中。
       稀盐酸乙醇溶液:用75%乙醇配制1%盐酸。
       系列浓度的乙醇、二甲本、中性树胶。
       培养瓶、培养皿、眼科镊、盖玻片、载玻片、显微镜。
       实验步骤
       样品制备:对于贴壁生长细胞,胰酶消化,调整细胞浓度约1×105/ml,滴加于盖玻片上(置于6孔板中),培养相应时间后,取出细胞爬片,用PBS 洗涤3次。
       样品固定:95%乙醇固定20min,PBS洗涤2次,每次1min。
       染核:苏木素染液染色2-3min,自来水洗涤。
       分色:镜下观察,若细胞核染色过深,用1%盐酸酒精溶液分色数秒,自来水洗涤。
       染胞质:浸入伊红染液染色1min,自来水洗涤。
       吹干或自然晾干细胞 爬片后,中性树胶封片。
       若细胞用4%多聚甲醛固定,则染色时间相应延长,苏木素染色12-15min,伊红5min即可。
       实验结果及注意事项

       实验结果

       细胞核呈蓝色,细胞质,肌纤维,胶原纤维和红细胞呈不同程度的红色。钙盐和细菌可呈蓝色或紫蓝色

       注意事项:
       1.  染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长,组织酸化而影响细胞核着色。因此,要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min,这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳,可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋suan。
       2.  切片染苏木晶后,分色这一步是关键,应在显微镜下控制进行,一般以细胞核染色清楚(晰)而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅,应重新染色后再行分色。
       3.  切片经酒精脱水后,入二甲本时可出现白色不透明状态,此为脱水不彻底,应将切片退回无水,酒精,更换酒精、二甲本,以求彻底脱水与透明。

       4.  在染色过程中不要让切片干燥,以免切片收缩、变形,影响神经元形态。

       5.  切片从二甲本取出或进入二甲本前,切片周边均应擦干净或吸干多余水分。

       6.  最后封固时,要用中性树脂,防止日后褪色,盖片要选大于组织块的面积,如漏出一部分不久将会褪色,所用树脂浓度要适当,树脂封固时不能有气泡。

 

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