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磷酸丙糖异构酶（Triose-phosphate isomerase，TPI） 试剂盒说明书
624 人阅读发布时间：2022-03-28 08:28
磷酸丙糖异构酶（Triose-phosphate isomerase，TPI）
试剂盒说明书
分光光度法50管/48样
注 意 ：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶是光合作用中参与calvin循环的重要酶。作用于磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮之间的转化，磷酸二羟丙酮能快速透过叶绿体的包膜进入细胞质，并在其中逐步转化为蔗糖。
测定原理：
磷酸丙糖异构酶将磷酸二羟丙酮转化为3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛与NAD在3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下生成3-磷酸甘油酸和NADH，340nm处的吸光度变化反映了磷酸丙糖异构酶的活性的高低。
自备实验用品及仪器：
天平、低温离心机、研钵、震荡仪、紫外分光光度计、1 mL石英比色皿。
试剂组成和配制：
提取液一：液体50mL×1瓶，4℃保存。
提取液二：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体30mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加5mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂三：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加5 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂四：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加5 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
酶液提取：
①总TPI酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g离心10min，取上清测定。
②胞浆和叶绿体TPI酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5～10的比例（建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一），冰浴匀浆后于4℃，200g离心5min，弃沉淀，取上清在4℃，8000g离心10min，取上清用于测定胞浆TPI酶活性，取沉淀加1mL提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g离心10min，取上清测定叶绿体中TPI酶活性。
建议测定总TPI酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的TPI，则按照步骤②提取粗酶液。
测定操作：
计算公式：
（1）按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
TPI（nmol/min /mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反总÷(V样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
TPI（nmol/min /g 鲜重）= ΔA÷（ε×d）×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T=321.54×ΔA÷W
V反总：反应体系总体积，1mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g
试剂盒说明书
分光光度法50管/48样
注 意 ：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶是光合作用中参与calvin循环的重要酶。作用于磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮之间的转化，磷酸二羟丙酮能快速透过叶绿体的包膜进入细胞质，并在其中逐步转化为蔗糖。
测定原理：
磷酸丙糖异构酶将磷酸二羟丙酮转化为3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛与NAD在3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下生成3-磷酸甘油酸和NADH，340nm处的吸光度变化反映了磷酸丙糖异构酶的活性的高低。
自备实验用品及仪器：
天平、低温离心机、研钵、震荡仪、紫外分光光度计、1 mL石英比色皿。
试剂组成和配制：
提取液一：液体50mL×1瓶，4℃保存。
提取液二：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体30mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加5mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂三：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加5 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂四：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加5 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
酶液提取：
①总TPI酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g离心10min，取上清测定。
②胞浆和叶绿体TPI酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5～10的比例（建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一），冰浴匀浆后于4℃，200g离心5min，弃沉淀，取上清在4℃，8000g离心10min，取上清用于测定胞浆TPI酶活性，取沉淀加1mL提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g离心10min，取上清测定叶绿体中TPI酶活性。
建议测定总TPI酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的TPI，则按照步骤②提取粗酶液。
测定操作：
- 分光光度计预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
- 取1mL石英比色皿，依次加入600μL试剂一，100μL试剂二，100μL试剂三，100μL试剂四，100μL粗酶液，充分混匀，记录340nm处10s的吸光值A1和310s的吸光值A2，△A=A2-A1
计算公式：
（1）按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
TPI（nmol/min /mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反总÷(V样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
TPI（nmol/min /g 鲜重）= ΔA÷（ε×d）×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T=321.54×ΔA÷W
V反总：反应体系总体积，1mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g