微量法 100 管/96 样
NAD-苹果酸脱氢酶（NAD-MDH）试剂盒说明书正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：
MDH （EC 1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中 MDH 是 TCA 循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中 MDH 催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物， 连接多条重要的代谢途径。因此，MDH 在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH 分为 NAD-依赖的 MDH 和 NADP-依赖的MDH，细菌中通常只含有 NAD-MDH，在真核细胞中，NAD-MDH 分布于细胞质和线粒体中。
测定原理：
NAD-MDH 催化NADH 还原草酰乙酸生成苹果酸，导致 340nm 处光吸收下降。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
试剂一、提取液 100 mL×1 瓶，在 4℃保存； 试剂二、液体 20 mL×1 瓶，在 4℃保存；
试剂三、粉剂×1 瓶，-20℃保存；
样本测定的准备：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量
（10⁴ 个）：试剂一体积（mL）为 1000~2000：1 的比例（建议 2000 万细菌或细胞加入 1mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、检测工作液的配制：用时在试剂三中加入 19mL 试剂二和 0.5mL 蒸馏水，充分混匀待用； 用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。；
3、测定前将检测工作液在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min 以上。
4、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 5μL 样本和 195μL 工作液，混匀后立即记录 340nm
处 20s 时的吸光值 A1 和 1min20s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。
注意：若 A1-A2 大于 0.5，需将样本用提取液稀释，使 A1-A2 小于 0.5，可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。
 
NAD-MDH 活力单位的计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清（浆）NAD-MDH 活力的计算
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷V 样÷T=6430×ΔA 2、组织、细菌或细胞中 NAD-MDH 活力的计算:
（1） 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 样÷V 样总）÷T
=6430×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。NAD-MDH（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷（2000×V 样÷V 样总）÷T=3.215×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.005 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，1 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；2000：细胞或细菌总数，2000 万。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
1、血清（浆）NAD-MDH 活力的计算
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷V 样÷T=12860×ΔA 2、组织、细菌或细胞中 NAD-MDH 活力的计算:
（1） 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=12860×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织中每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 样÷V 样总）÷T
=12860×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。NAD-MDH（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷（2000×V 样÷V 样总）÷T=6.43×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d： 96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.005 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL； T：反应时间，1 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；2000：细胞或细菌总数，2000 万。